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流式细胞术(flow cytometry,FCM)是单克隆抗体、免疫细胞化学技术、荧光标记、激光技术和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。工作原理是使悬浮在液体中的分散的荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池,被激光器发出的激光激发荧光物质发射出荧光。由荧光探测器捕获该荧光信号,这些荧光信号再经过光电转换器(光电二极管和光电倍增管)转换成电信号,经计算机处理后形成相应的图像后进行数据分析。

流式细胞术可以对细胞(表面或内部物质)或亚细胞结构(胞内DNA、mRNA、miRNA、蛋白质、钙离子、活性氧、染色体等)或相关微粒(微球、细菌、真菌等)进行快速定性分析、定量分析和选择性分离。

流式细胞术的优势

1、测量速度之快,可在1秒内计测出数以万计个细胞;

2、测量参数之多,可对同一个细胞或微粒做有关物理、化学特性的近百种参数测定,并具有明显的统计学意义;

3、研究范围之广,可研究蛋白质(表面蛋白质、胞内蛋白质),又可以研究基因(DNA、mRNA、microRNA);

4、样本分析之能,流式细胞分析的样本一般要求是单细胞悬液,可以是血液(抗凝全血、血清、血浆),悬浮细胞培养液,各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液,人造微粒(微球)以及石蜡包埋组织的单细胞悬液

经典案例
  • 细胞凋亡
  • 线粒体膜电位检测JC-1
  • 细胞周期-PI
  • 活细胞周期-Hoechst 33342
  • 活性氧检测
  • 巨噬细胞吞噬实验
  • 小鼠脾细胞表型分析
  • 9色人白细胞免疫表型分析
  • 小鼠肿瘤Th1/2/Treg检测
  • CFSE细胞增殖
  • BrdU细胞增殖
  • CBA流式微球法
  • DC 细胞检测
  • 细菌/细胞/微颗粒死活与绝对计数
  • 血小板活化检测
  • 淋巴细胞分离
  • 常见配色方案

细胞凋亡时会发生一系列形态学特征的变化,质膜的改变是凋亡早期的特征之一,例如质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)重新分布,由胞膜内侧翻转到胞膜外侧,暴露于细胞外表面,Annexin-V是一种分子量在35-36KD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白,能够与细胞凋亡过程翻转到膜外的PS高亲和力特异性的结合,在Annexin-V上链接一种荧光染料(如FITC,就可以通过流式监测到早期凋亡的发生;PI(Propidium iodide)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,而凋亡中晚期的细胞和死细胞细胞膜破损,PI能够透过而使细胞核染色。可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。


    线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降,同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-1检测线粒体膜电位的效果参考图1。

    JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。


    以哺乳动物细胞为例,细胞周期分为不同的时相:G0期是细胞静止期,不在细胞周期内(2C DNA);G1期既是一次分裂的结束又是另一个周期的开始(2C DNA);细胞在S期合成新的 DNA(2C DNA~4CDNA);G2期完成DNA复制,拥有两倍于正常细胞的DNA量(4C DNA);M 期是有丝分裂期,同样含有4C DNA量,在这个时相经历染色质浓缩和组织,将遗传物质平均分配到两个子细胞中,每一个子细胞都是2C DNA。

     在不同的细胞周期时相中,DNA 含量存在差异,用核酸染料(如 PI 和 Hoechst 33342)对 DNA 进行染色,根剧DNA 荧光强度的变化,判断细胞所处的细胞周期时相(G1、S、G2、M),再根据各时相中的细胞数算出其所占细胞总数的百分比。



     Hoechst 33342是DNA染料之一,其特点是不需要固定便可透过细胞膜。对比PI、7-AAD、DAPI等不具备透膜能力的核酸染料,在周期检测同时可以进行荧光蛋白检测。


活性氧检测(Reactiveoxygen species assay)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的方法。DCFH-DA本身没有荧光,可以自有穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的脂酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。



    巨噬细胞承担着吞噬、消除细胞内寄生菌、真菌,和清除衰老的自身细胞的职能,它在特异性体液免疫或细胞免疫应答中都有着重要的作用,所以巨噬细胞的吞噬消化功能,在一定程度上可以反映机体的免疫状态。

    激活的巨噬细胞具有吞噬表面带有阳性可调理基团荧光微球的功能,将含有巨噬细胞的腹腔液与调理过的荧光微球孵育一定时间后,去除多余未被吞噬的微球,收集以吞噬细胞为主的标本,用流式细胞仪检测吞噬细胞吞噬能力具有检验快速、准确的特点。



脾脏是机体最大的免疫器官,含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞,是机体细胞免疫和体液免疫的中心,当机体免疫失衡时,免疫细胞的数量和比例都会发生变化,流式细胞仪能够直接检测出该变化的发生。该实验通过一个4色方案,检测出了小鼠脾脏中T细胞亚群。


对人外周血白细胞细胞表型的多色检测,可以一管实现B细胞、T细胞及T细胞亚群、活化、分化的检测,在免疫功能监测中有重要的意义。


       细胞间的信息传递通过可溶性生物介质,如细胞因子、趋化因子介导。细胞因子具有广泛调节细胞功能的作用,包括细胞增殖、分化和效应功能。对于辅助性T细胞的应答细胞因子发挥着重要作用,对Th1、Th2、Th17、Th22、Treg(调节性T细胞)和最新发现的Th9、Tfh(滤泡性辅助T细胞)。通过免疫细胞纯化,刺激培养,加以高尔基体阻断剂,可将分泌型细胞因子阻断到细胞内,最终通过流式仪检测。


       荧光染料 CFSE(CFDA-SE),是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料,可以标记活体细胞。其基本原理如下:CFSE能够轻易穿透细胞膜,在活细胞内与胞内蛋白共价结合,水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中,它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减,标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半,根据这一特性,它可被用于检测细胞增殖、细胞周期的估算及细胞分裂等方面。


       5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),是人工合成的胸腺嘧啶(thymidine)类似物,在DNA合成期(S期),BrdU能够代替胸腺嘧啶而渗入正在复制的DNA分子中,然后用荧光标记的BrdU 抗体进行染色,就可以对细胞增殖进行检测。在BrdU 检测同时加入 DNA 染料同时对细胞周期进行检测,是对细胞同时进行周期、增殖检测的完美流式解决方案。


        Cytometric Bead Array(CBA),即微量样本多重蛋白定量技术是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法。它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。首先利用一系列带有荧光标记的微球连结特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物,然后再通过相对应的各种不同检测物特异微球上的不同荧光强度同时定量测定分析样本中多种可溶性成分。


        DC 细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞,是启动、调控和维持免疫应答中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞,当细胞数量达到一定数量后回输给病人,可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。


       传统的细菌检测耗时长、误差大、操作繁琐,相比之下,流式细胞术具有灵敏、快速、准确、高效的优势,同时可提供更多细菌的生物学信息,在实验室研究、临床诊断、工业生产、环境监测等众多领域极具应用前景。在以往的细胞活性鉴定中,通常以Anneixn V/PI联合法,区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡以及死细胞;僵尸染料(可与伯胺结合)既可检测未固定的流式样本,也可检测固定的流式样本;PI或7-AAD等核酸结合染料,只能用于未固定的流式样本的死活细胞检测。PI、7-AAD、SYTOX等核酸类染料也可以用到细菌活性检测中,用于区分细菌死活,并进行计数。


       CD62p(也称为P-选择素,GMP140)是一种位于血小板特殊颗粒和血管内皮细胞的weibe-palade小体内的膜糖蛋白。在正常情况下CD62P只少量表达在血小板表面,当血小板受到刺激时,迅速大量地在血小板表面表达,通过N端的凝集素样结构域作用,接到火花的内皮细胞与单核细胞、中性粒细胞等的粘附功能,这些细胞不仅促进纤维蛋白沉积,还参与炎症反应和血栓的形成。用抗GMP140抗体处理活化的血小板后,其相互之间的黏附作用立即消失,说明GMP140可介导活化小小白或内皮细胞与白细胞之间的粘附,是血小板活化的重要标志物之一。ADP、AA、PAF均可有效的刺激血小板活化。


       在很多流式检测中,需要外周血、脾脏、肿瘤等血液或组织中分离纯化出淋巴细胞,直接裂解红细胞可迅速去除样本大量的红细胞干扰,但无法清除其他类型的有核细胞,因此利用淋巴细胞分离液加以规范化的操作,可有效分离出样本中的淋巴细胞。